TUGAS
MAKALAH
Peran
Rekayasa Genetika dalam
Pengembangan
Bioteknologi Molekuler
Nama :
ABD.RAHMAN
N
I M : H311 08 011
\
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2011
Peran Rekayasa Genetika dalam
Pengembangan Bioteknologi Molekuler
A. Pendahuluan
Rekayasa genetika (Inggris. genetic engineering)
dalam arti paling luas adalah penerapan genetika untuk kepentingan manusia.
Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaan hewan atau tanaman melalui seleksi
dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula penerapan mutasi buatan tanpa
target dapat pula dimasukkan. Walaupun demikian, masyarakat ilmiah sekarang
lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik
biologi molekular untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah
sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu.
Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua
golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan
tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Bidang kedokteran dan farmasi paling
banyak berinvestasi di bidang yang relatif baru ini. Sementara itu bidang lain,
seperti ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanian (termasuk peternakan dan
perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk
mengembangkan bidang masing-masing.
B. PEMBAHASAN DAN PERKEMBANGAN.
Ilmu terapan ini dapat dianggap sebagai cabang
biologi maupun sebagai ilmu-ilmu rekayasa (keteknikan). Dapat dianggap, awal
mulanya adalah dari usaha-usaha yang dilakukan untuk menyingkap material yang
diwariskan dari satu generasi ke generasi yang lain. Ketika orang mengetahui
bahwa kromosom adalah material yang membawa bahan terwariskan itu (disebut gen)
maka itulah awal mula ilmu ini. Tentu saja, penemuan struktur DNA menjadi titik
yang paling pokok karena dari sinilah orang kemudian dapat menentukan bagaimana
sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi DNA, yang adalah suatu polimer
bervariasi.
Tahap-tahap penting berikutnya adalah serangkaian
penemuan enzim restriksi (pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA
(diawali dari penemuan operon laktosa pada prokariota), perakitan teknik PCR,
transformasi genetik, teknik peredaman gen (termasuk interferensi RNA), dan
teknik mutasi terarah (seperti Tilling). Sejalan dengan penemuan-penemuan
penting itu, perkembangan di bidang biostatistika, bioinformatika dan
robotika/automasi memainkan peranan penting dalam kemajuan dan efisiensi kerja
bidang ini.
Perkembangan genetika pada saat ini telah sangat pesat. Sejak
struktur DNA diketahui dan juga kode genetika sudah dapat dipecahkan maka
perkembangan di bidang genetika akan lebih pesat lagi. Beberapa ahli
biomolekuler berhasil melakukan rekayasa genetika, seperti pemotongan gen yang
terkontrol, dan rekombinasi DNA yang dilakukan dengan proses kloning DNA
(kloning gen). Rekayasa genetika melalui DNA rekombinan atau kloning gen secara
in vitro dapat menciptakan rekombinasi genetik yang tidak terbatas dan dengan
menggunakan teknik ini telah dihasilkan berbagai zat, misalnya insulin pada
manusia, hormon pertumbuhan manusia, interferon alfa, dan vaksin hepatitis B.
Perkembangan bioteknologi secara drastis terjadi sejak ditemukannya
struktur helik ganda DNA dan teknologi DNA rekombinan di awal tahun 1950-an.
Ilmu pengetahuan telah sampai pada suatu titik yang memungkinkan orang untuk
memanipulasi suatu organisme di taraf seluler dan molekuler. Bioteknologi mampu
melakukan perbaikan galur dengan cepat dan dapat diprediksi, juga dapat
merancang galur dengan bahan genetika tambahan yang tidak pernah ada pada galur
asalnya. Memanipulasi organisme hidup untuk kepentingan manusia bukan merupakan
hal yang baru. Bioteknologi molekuler menawarkan cara baru untuk memanipulasi
organisme hidup. Perkembangan teknologi mutakhir diiringi dengan perkembangan
dibidang biokimia dan biologi molekuler melahirkan teknologi enzim dan rekayasa genetika. Rekayasa genetika menandai dimulainya era
bioteknologi modern.
Penemuan struktur double heliks DNA (gambar 1) oleh Watson dan Cricks
(1953) telah membuka jalan lahirnya bioteknologi modern
dalam bidang rekayasa genetika
yang merupakan prosedur
dasar dalam menghasilkan suatu produk bioteknologi. Tahap-tahap penting
berikutnya adalah serangkaian penemuan enzim
restriksi (pemotong) DNA,
regulasi (pengaturan ekspresi) gen
(diawali dari penemuan
operon laktosa pada prokariota),
perakitan teknik PCR, transformasi genetik, teknik peredaman gen (termasuk interferensi RNA), dan teknik mutasi terarah
(seperti Tilling).
.
Rekayasa
genetika bermain pada tingkat molekuler khususnya DNA. Beberapa tahapan yang
digunakan dalam rekayasa genetika yaitu isolasi DNA, manipulasi DNA, perbanyakan DNA dan
visualisasi hasil manipulasi DNA, DNA rekombinan, dan Kloning Gen.
1. Isolasi DNA
Belakangan
ini kita sering mendengar kata DNA di berbagai media, baik cetak maupun elektronik. Setelah
terjadinya peristiwa peledakan bom, kasus pemerkosaan ataupun pembunuhan maka
biasanya tim penyelidik dari kepolisian akan mengirimkan sampel untuk analisa
DNA yang dikenal dengan istilah uji sidik DNA. DNA (DeoxyriboNucleic Acid) yang
merupakan asam nukleat pembawa pesan genetik dalam kehidupan terletak di dalam
sel dan tersusun rapi membentuk kromosom.
Pola DNA
penyusun kromosom inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan
sifat-sifat khusus yang berbeda antara satu individu dengan lainnya. Karena
perbedaan DNA yang dimiliki oleh seseorang inilah metode sidik DNA menjadi salah
satu alat pembuktian yang cukup handal. Namun karena letaknya yang ada didalam
sel maka untuk mendapatkan DNA diperlukan tahap-tahap khusus yang biasanya dilakukan di
laboratorium tertentu.
DNA
dapat diisolasi dari semua bagian tubuh misalnya dari daging, darah,
sperma, ginjal, jantung, hati, dan
lain-lain. Begitu pun untuk tanaman, DNA dapat diambil dari semua bagian. DNA
juga bisa diperoleh dari spesimen yang berumur ratusan tahun atau fosil.
Untuk
mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan
dengan merusak dinding sel yang telah dilarutkan dalam larutan penyangga tertentu dengan menggunakan
berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan sel maka DNA dapat dikeluarkan
dan diendapkan dengan penambahan alkohol.
2. Manipulasi DNA
Untuk
memanipulasi DNA, diperlukan beberapa perangkat penting meliputi “gunting” untuk memotong molekul DNA, “lem/perekat” untuk menggabungkan molekul
DNA, dan “gergaji” untuk membelah molekul DNA.
2.1. Pemotongan molekul DNA
Pada proses pemotongan molekul
DNA, “gunting” yang dimaksud bukanlah gunting yang biasa kita pakai untuk
memotong sesuatu, tetapi merupakan suatu enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme tertentu.
Enzim ini dikenal dengan nama enzim restriksi. Setiap enzim restriksi mempunyai
tempat pemotongan yang spesifik pada suatu urutan molekul DNA. Sebagai contoh adalah
enzim EcoRI yang selalu memotong DNA pada posisi G ! AATTC (tanda ! merupakan tempat
pemotongan), seperti terlihat pada molekul di bawah ini :
2.2. Penggabungan molekul DNA
Proses
penggabungan (ligasi) antara dua molekul DNA menggunakan lem/perekat berupa
enzim, yang dikenal dengan nama enzim ligase. Enzim ini berfungsi mensintesis
pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan
nukleotida di sebelahnya. Berikut adalah contoh penggabungan dua molekul DNA (A
dan B) menjadi molekul AB :
Jadi,
fungsi DNA ligase hanya membuat ikatan fosfodiester yang menghubungkan basa G
dan basa C pada urutan DNA bagian atas, dan basa C dengan basa A pada urutan
DNA bagian bawah.
3. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan suatu reaksi
enzimatis untuk melipatgandakan suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama
kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985.
Dengan menggunakan metode PCR, akan diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA
sebesar 200.000 kali melalui
20 siklus reaksi selama 220
menit. Pembelahan molekul DNA sangat penting dalam proses amplifikasi DNA
melalui teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase.
Seperti telah diketahui bahwa molekul DNA selalu dalam keadaan berpasangan
(double stranded DNA),dan untuk membelah
molekul DNA digunakan “gergaji” yang bisa berupa pemanasan (suhu ≥ 90 oC)
atau dengan larutan NaOH (konsentrasi 0,4 M).
Empat komponen utama dalam
proses PCR adalah :
1.
DNA cetakan yaitu fragmen DNA
yang akan dilipatgandakan.
2.
Oligonukleotida primer, yaitu
suatu urutan nukleotida pendek ( 15-25 basa nukleotida), digunakan untuk
mengawali sintesis rantai DNA.
3.
Deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dan dCTP .
4.
Enzim DNA polimerase, yaitu
enzim yang mengkatalisis reaksi sintesis DNA.
PCR
melibatkan banyak siklus yang masing-masing mempunyai tiga tahapan berulang
yaitu denaturasi DNA cetakan pada suhu 94-100
oC, annealing (penempelan) pasangan primer pada DNA target
pada suhu 37-60 oC, dan extension (pemanjangan) primer pada suhu 72 oC
(Gambar 3.).
4. Elektroforesis
Untuk menganalisis hasil
manipulasi DNA dapat dilihat melalui elektroforesis. Elektroforesis adalah suatu teknik yang menggunakan
medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran. Karena mengandung
fosfat yang bermuatan negatif, DNA akan
bergerak menuju elektroda positif dalam medan listrik. Prinsip alat ini adalah : kecepatan migrasi molekul DNA berbeda-beda
tergantung pada beberapa faktor
diantaranya ukuran molekul. DNA bermigrasi di dalam gel padat yang terletak di dalam
larutan penyangga yang dialiri arus listrik seperti pada gambar 4 berikut ini :
Molekul
yang lebih pendek akan bermigrasi lebih cepat melalui pori-pori gel daripada
molekul yang lebih panjang. Ada dua jenis gel yang sering digunakan untuk proses
elektroforesis, yaitu gel agarose dan gel polyacrilamida. Gel agarosa, digunakan untuk memisahkan
molekul-molekul DNA yang perbedaan panjangnya hanya satu nukleotida dan digunakan
untuk menentukan urutan basa DNA. Gel poliakrilamid digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar.
Pita DNA
pada gel dapat dilihat dengan menggunakan berbagai teknik. Pemberian zat warna ethidium
bromide, memungkinkan visualisasi langsung semua pita DNA di bawah sinar UV
dengan menggunakan alat transiluminator dan dilakukan pada ruangan khusus yang
gelap. Hasil visualisasi DNA kemudian difoto. Urutan yang spesifik biasanya
dapat dideteksi dengan probe berlabel. Probe adalah DNA untai tunggal yang
dapat membentuk pasangan basa dengan uruan komplementer pada polinukleotida untai
tunggal lain yang tersusun dari DNA atau RNA.
5.
Pengurutan DNA (DNA Sekuensing)
Urutan
nukleotida DNA dari sebagian besar organisme masih tidak diketahui. Mengetahui
urutan dari DNA suatu oganisme atau suatu klon fragment DNA memberikan informasi
yang sangat berharga untuk studi lanjutan. Urutan dari suatu gen dapat
digunakan untuk memprediksi fungsi dari gen, untuk membandingkannya dengan urutan
yang sama dari organisme yang berbeda, dan untuk mengidentifikasi mutasi atau
keselahan dalam urutan DNA. Hal ini karena genom dari sebagian besar organisme
terdiri dari milyaran nukleotida seh ingga molekul DNA yang digunakan untuk
reaksi sekuensing harus dipotong terlebih dahulu menjadi fragmen yang lebih
kecil dengan menggunakan enzim restriksi.
Gambar 7
merupakan proses untuk memahami bagaimana DNA disekuensing. Kita mencampurkan suatu
fragment DNA yang tidak dketahui, DNA polimerase, dan 4 jenis nukelotida yaitu
A, C, G, T dalam suatu tabung. Masing-masing nukelotida dalam jumlah sedikit diberi
pewarna fluorescen (berpendar) yang juga
memodifikasi struktur nukleotida.
Apabila sebuah nukelotida modifikasi berfluorescent bergabung dalam rantai
sintesis baru, maka reaksi akan berhenti. Hal ini akan menghasilkan rantai DNA dengan
panjang yang berbeda-beda. Reaksi sekuensing sudah lengkap jika fragment DNA
dipisahkan dengan menggunakan elektroforesis gel. Gel kemudian dianalisis dalam
suatu mesin sekuensing otomatis untuk mendeteksi warna dari masing-masing nukelotida
bertanda. Urutan dari cetakan DNA asal
akan terlihat dari perbedaan fragmen
bertanda.
6. DNA rekombinan
Secara alami, proses rekombinasi
dapat terjadi sehingga memungkinkan suatu gen dapat berpindah dari satu
organisme ke organisme lain. Persitiwa tersebut biasanya terjadi diantara organisme
yang memiliki kekerabatan yang dekat.
Dengan kemajuan teknologi molekuler, perpindahan gen dapat terjadi meskipun
antara organisme yang tidak memiliki hubungan kekerabatan. Misalnya gen manusia
yang dipindahkan ke bakteri atau ke hewan seperti babi. Teknik penggabungan
molekul DNA tersebut dikenal sebagai Teknik rekombinan DNA.
Untuk
membuat DNA rekombinan digunakan dua macam enzim yaitu enzim restriksi yang
berfungsi memotong molekul DNA dan enzim ligase yang berfungsi menggabungkan molekul
DNA. Proses masuknya DNA rekombinan ke sel bakteri disebut transformasi, dan proses ini dapat
menyebabkan fenotip sel bakteri mengalami perubahan. Untuk mengetahui sel
bakteri telah mengandung DNA rekombinan, maka sel bakteri ditumbuhkan dalam medium
padat yang mengandung antibiotik, X-gal ( zat kimia yang berfungsi sebagai
indikator) dan IPTG (zat kimia yang berfungsi sebagai inducer). Jika sel bakteri tersebut
mengandung DNA rekombinan, maka terdapat koloni berwarna putih pada kultur
medium padat.
Penggunaan
teknik DNA rekombinan untuk diagnosis penyakit dengan memanfaatkan sifat polimorfisme
DNA. Seperti diketahui bahwa polimorfisme dalam genom berfungsi sebagai dasar
bagi penggunaan teknik DNA rekombinan dalam diagnostik penyakit. Polimorfisme adalah
variasi dalam urutan DNA. Dalam genom manusia terdapat jutaan polimorfisme yang
berlainan. Yang pertama kali diidentifikasi adalah mutasi titik, substitusi (penggantian)
satu basa oleh basa lain. Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa delesi (penghilangan)
dan insersi (penyisipan) juga bertanggung jawab atas variasi dalam urutan DNA.
Sebagian polimorfisme terjadi di dalam daerah pengkode gen. Untuk mendeteksi
adanya polimorfisme menggunakan polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP
: restriction fragment length polymorphism)
7. Kloning Gen
Kloning merupakan suatu
teknik untuk menghasilkan banyak salinan dari satu gen tunggal,
kromosom, atau keseluruhan individu. Klon (clone) berasal dari kata Yunani yang
berarti ranting. Jaringan-jaringan non reproduktif digunakan untuk pengklonan keseluruhan
individu. Secara alami, seringkali
proses kloning
terjadi. Misalnya pada
tanaman kentang yang mampu berkembang biak secara vegetatif yaitu mampu menghasilkan
tanaman baru dari tuber (umbi). Dalam hal ini, kentang bisa dikatakan mengalami
proses kloning.
Kloning
dapat diartikan perbanyakan sel maupun individu secara vegetatif sehingga
menghasilkan individu yang identik sama dan seragam dengan induknya.
Kloning
juga terjadi karena pengaruh atau campur tangan manusia. Kultur jaringan atau
mikropropagasi merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman dengan menempatkan
sejumlah kecil sel yang berasal dari tanaman induk yang kemudian ditumbuhkan dalam
medium kaya nutrien yang mengandung hormon pertumbuhan.
Secara
konvensional, kloning dapat dilakukan pada tumbuhan, misalnya setek batang dan
setek daun, menyambung, dan mencangkok. Adapun secara modern dapat dilakukan
dengan teknik kultur jaringan.
Kloning
DNA adalah memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu sel bakteri, DNA yang
dimasukkan ini akan bereplikasi dan diturunkan pada sel anak pada waktu sel
tersebut membelah. Jadi gen asing ini tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya,
walaupun berada dalam sel bakteri. Pembentukan DNA rekombinan ini disebut juga
rekayasa genetika. Perekayasaan genetika terhadap satu sel dapat dilakukan dengan
hanya menghilangkan, menyisipkan atau menularkan satu atau beberapa pasang basa
nukleotida penyusun molekul DNA tersebut. Untuk kloning ini diperlukan plasmid
dan enzim untuk memotong DNA, serta enzim untuk menyambungkan gen yang disisipkan
itu ke plasmid.
Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing atau DNA yang diinginkan
atau DNA sasaran harus memenuhi hal-hal sebagai berikut.
1.
DNA plasmid vektor harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim yang
sesuai sehingga terbuka. DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk
membentuk rekombinan buatan harus dipotong dengan enzim yang sama.
2.
Reaksi pemotongan dan penggabungan harus dipantau dengan
menggunakan elektroforesis gel.
3.
Rekombinan buatan harus ditransformasikan ke E. coli
atau ke vektor lainnya.
4.
Tahapan proses kloning DNA (gambar 9) adalah melakukan isolasi DNA
plasmid dan DNA target.
5.
Menggunakan enzim restriksi untuk memotong DNA sehingga diperoleh
fragment DNA target.
6.
Selanjutnya DNA target disisipkan pada plasmid dan
ditransformasikan ke dalam sel inang.
7.
Hasilnya akan diperoleh bakteri yang mengandung DNA rekombinan dan
ada pula bakteri yang tidak mengalami proses transformasi. Untuk membedakannya,
digunakan medium selektif yang mengandung antibiotik. Bakteri yang mengandung
DNA rekombinan mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik sehingga akan
tetap hidup dalam medium selektif.
8.
Bakteri rekombinan diperbanyak dengan cara kloning sehingga
diperoleh klon-klon dalam jumlah yang besar yang bias digunakan dalam berbagai
bidang seperti untuk menemukan gen yang resisten hama, gen yang bisa membuat
bakteri membersihkan toksik, gen untuk meghasilkan hormon, dan lain-lain.
Karena
adanya teknik rekayasa genetika di atas maka dengan mudah kita menciptakan
suatu bioteknologi molekuler terbaru yang dapat bemanfaat, contohnya pada
organisme transgenik yang dihasilkan dari rekayasa genetika. Ada 3 macam
organisme transgenik yang telah ditemukan saat ini, yaitu:
1.
Hewan transgenik
Beberapa organisme transgenik telah dihasilkan untuk
meningkatkan pasokan makanan dan kesehatan manusia. Kambing transgenik telah
direkayasa untuk mensekresi protein yang disebut anti trombin III, yang
digunakan untuk mencegah manusia membentuk gumpalan-gumpalan darah selama operasi.
Para peneliti berupaya untuk menghasilkan ayam dan
kalkun transgenik yang tahan terhadap penyakit. Beberapa spesies ikan juga
telah direkayasa secara genetis untuk tumbuh lebih cepat. Di masa depan, transgenik
organisme dapat digunakan sebagai sumber organ untuk transplantasi organ.
2.
Tanaman transgenik
Pada tahun 2003,
sekitar 67.7 juta hektar telah
ditanami dengan tanaman transgenik oleh 7 juta petani di 18 negara. Tanaman ini
termasuk kedelai, jagung, kapas, dan
canola tahan herbisida
dan insektisida. Rekayasa genetika
juga dilakukan untuk menghasilkan kapas, seperti tahan terhadap hama serangga.
Selain itu, para peneliti juga mengembangkan kacang
dan kedelai yang tidak menyebabkan reaksi alergi. Tanaman lain yang ditanam secara komersial
dan telah diuji termasuk tanaman ubi
jalar yang resisten terhadap virus yang
dapat mengurangi panen di
sebagian besar Afrika, tanaman padi dengan mengandung besi dan vitamin yang bisa
mengurangi kekurangan gizi di negara-negara Asia, tanaman mampu
bertahan kondisi cuaca ekstrim,
tanaman pisang yang memproduksi vaksin untuk penyakit menular, seperti
hepatitis B, dan tanaman yang memproduksi plastik biodegradable.
3.
Bakteri Transgenik
Insulin, hormon pertumbuhan, dan zat yang melarutkan gumpalan darah dapat dibuat oleh bakteri transgenik. Transgenik bakteri
juga memperlambat pembentukan kristal es pada tanaman untuk melindungi mereka
dari kerusakan embun beku, membersihkan tumpahan minyak secara lebih efisien,
dan sampah membusuk.
C. KESIMPULAN
Dalam perkembangan Bioteknologi
Molekuler tidak akan pernah lepas dari peran Rekayasa Genetika yang menjadi
awal dan batu loncatan untuk semua bioteknologi molekuler yang telah kita
rasakan saat ini. Jadi rekayasa genetika memiliki peran yang sangat penting
dalam proses perkembangan bioteknologi molekuler yang sampai saat ini banyak
digunakan di seluruh dunia IPTEK.
DAFTAR
PUSTAKA
Biggs,
Alton., etc., 2008, Biology, Mc Graw
Hill, New York.
Campbell, N.A., etc.,
2009, Biology, 8th edition, Pearson Benjamin Cumming, San Fransisco.
Djuminar, A., 2006, Biologi Molekuler, Poltekkes Jurusan
Analis Kesehatan, Bandung.
Ibrahim, M., dkk.,
2004, Sains, Materi Pelatihan Terintegrasi, Dirjen Pendidikan Dasar dan
Menengah, Jakarta.
Kee, L.H., 2002, The Living Science, Pearson Education
Asia Pte. Ltd., Singapore.
Muladno, 2002, Seputar Teknologi Rekayasa Genetika, Penerbit
Pustaka Wirausaha Muda, Bogor.
Nur Azhar, T., 2008, Dasar-dasar Biologi Molekuler, Penerbit Widya
Padjadjaran, Bandung.
Ridley, M., 2005, Genom: Kisah Spesies Manusia dalam 23 Bab,
PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Sumastri,
2005, Bioteknologi, PPPG IPA Bandung, Bandung.
Susilowarno,
G., dkk., 2007, Biologi SMA/MA Kelas XII,
PT. Grasindo, Jakarta.
Yuwono, T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction,
Penerbit Andi, Yogyakarta.